优化成像和传感用有机荧光团特性的化学方法

图表摘要

摘要

有机荧光团作为现代生物与生物医学成像领域的核心工具，其在细胞、组织乃至活体层面的可视化研究中发挥着不可替代的作用，推动了该领域技术的显著进步。然而，尽管其应用广泛且深入，当前市场上众多荧光染料仍面临一系列性能瓶颈，包括但不限于吸收与发射光谱波长较短、发光强度不足、化学稳定性欠缺、斯托克斯位移有限以及生物膜穿透能力不理想等问题，这些局限性严重制约了它们在前沿成像技术和复杂生物环境中的应用潜力。

为克服这些挑战，过去二十年间，科研界致力于荧光团性能的优化与改良，通过深入探索其发光机制，逐步揭示了传统荧光团性能缺陷的根源所在。基于这些理解，一系列创新性的改良策略应运而生，旨在显著提升荧光团的各项关键性能指标。这些策略涵盖了分子结构的巧妙设计、新型合成路径的开发、以及通过化学修饰引入特定功能基团等，有效解决了荧光团在亮度、稳定性、光谱特性及生物相容性等方面的不足。

1. 引言

荧光成像技术，作为生物分析领域的璀璨明珠，凭借其卓越的时空分辨率、无创检测及实时追踪能力，在生命科学研究与临床病理诊断中占据了举足轻重的地位。相较于核磁共振成像（MRI）、超声成像（US）、正电子发射断层扫描（PET）及X射线计算机断层扫描（CT）等传统成像手段，荧光成像展现出了无可比拟的优势，为揭示生物分子的动态变化、相互作用及结构特征提供了强有力的工具。

随着科学探索与生物技术应用需求的日益增长，荧光成像技术不断革新，涌现出诸如单分子成像、超分辨率成像、多色成像、近红外二区（NIR-II）成像及三维成像等尖端技术。这些技术的核心在于利用精心设计的分子探针，其中经典荧光团如香豆素、NBD、萘酰亚胺、BODIPY、噁嗪、呫吨类（包括吡咯宁、罗丹明、荧光素、罗丹醇）、花菁及半花菁化合物等，扮演着至关重要的角色。然而，传统荧光团在吸收与发射波长、亮度、光稳定性、斯托克斯位移及生物渗透性等方面的局限性，限制了其在高质量成像中的应用潜力。

为克服这些挑战，化学家们开发了多种创新策略，旨在优化有机荧光团的性能。这些策略包括实现吸收与发射波长的红移以减少生物组织散射与自发荧光的干扰，提升荧光亮度以在低激发强度下实现高效成像，增强光稳定性以保障长期监测的准确性，增大斯托克斯位移以减少自淬灭现象并提高信噪比，以及调节渗透性以促进染料在生物体内的有效分布与标记。这些改进不仅提升了成像的深度与清晰度，还拓宽了荧光团在生物医学研究中的应用范围。

图 1 一些有机荧光团的结构。

2. 传统染料性能有限的理论基础

传统的荧光团尽管结构各异，但其核心发光机制遵循统一的物理原理，这一机制可通过Jabłoński图形象地加以阐释。在光子的激发作用下，荧光团分子能够跃迁，从稳定的基态（S₀）跃升至多个激发态（S_n, 其中n>1）或直接进入第一单激发态（S₁）。遵循卡沙法则与弗兰克-康顿原理（如图2所示），处于高能级S_n的荧光体将经历振动弛豫过程，逐渐降低至低能态，直至与相邻低能级S_n-1的高能态发生重叠。此时，分子通过内部转换机制无损失地转移至S_n-1的高能态，此过程伴随振动弛豫与内部转换的反复迭代，直至荧光团稳定在S₁的最低振动能级。

在S₁态，荧光团分子面临三种能量耗散途径：其一，通过辐射过程（即荧光发射）跃迁回基态S₀，释放光子；其二，经历非辐射跃迁，如热振动或内转换，不伴随光子发射；其三，通过系统间交叉（ISC）无能量损失地进入三重激发态（T₁）。理论上，S₁与S₀之间的能隙大小直接关联于辐射能量的释放量，进而影响发射光谱的最大波长、荧光亮度等特性。非辐射能量损失则涉及更为复杂的分子内过程，主要包括分子内电荷转移（TICT）的形成、荧光团与周围介质分子的相互作用，以及因聚集导致的荧光淬灭现象。

斯托克斯位移作为荧光光谱的一个重要特征，其大小与振动弛豫过程中能量的损失程度紧密相关。类似地，T₁态的荧光团也会经历振动弛豫，达到其最低能级，并以磷光的形式缓慢释放能量。值得注意的是，T₁态的高能量状态（>1 eV）使得荧光团易于遭受光漂白，这一过程常涉及T₁态与环境中氧分子的相互作用，生成高反应活性的单线态氧（¹O₂），后者能破坏荧光团结构，引发光漂白。此外，T₁态荧光团还可能与氧化还原活性物质或亲核基团（如分子氧、硫醇、氨基酸侧链）反应，生成非荧光加合物，进一步加剧光漂白现象。

在开发改良型荧光团并将其应用于细胞及体内成像领域时，必须充分考虑荧光团的细胞渗透性。这一性质受荧光团分子的极性、尺寸及亲脂性等因素的共同影响，而针对荧光团进行的结构改性往往会引起这些理化性质的相应变化。因此，在推广使用前，对改良型荧光团的细胞渗透性进行全面评估显得尤为重要，以确保其在生物成像应用中的有效性与安全性。

图 2 Jabłoński 图。

3 优化有机荧光团特性的化学方法

3.1 有机荧光团的吸收和发射光谱的调控

在荧光成像技术中，利用长波长荧光团进行成像能够显著降低生物组织自发荧光和散射效应的干扰，同时显著增强成像的穿透深度。荧光团的吸收与发射特性主要受到其最高占位分子轨道（HOMO）与最低未占位分子轨道（LUMO）之间能隙的调控。具体而言，相较于短波长荧光团而言，长波长荧光团通常展现出较小的HOMO-LUMO能隙。理论上，通过精细的分子结构改性，可以有效缩小这一能隙，从而实现荧光团吸收与发射光谱的红移。

针对这一目标，科学家们采取了多种策略，这些策略虽然基于不同的有机荧光团结构，但均遵循相同的物理原理。核心策略包括调控分子内的电子效应（也称为推拉效应）以及扩展共轭π结构。

在调控电子效应方面，主要存在两种策略：一是通过增加供体基团的电子密度，二是降低受体基团的电子密度。前者常通过引入强电子供体如氨基烷基化或具有更强供电子能力的取代基（如二乙基氨基）来实现。以罗丹明染料为例，罗丹明 110的最大吸收/发射（Abs/Em_max）在 497/520 纳米，在氨基上引入两个甲基可将吸收/发射最大值红移到 548/572 纳米，与二甲基氨基相比，二乙基氨基和久洛尼定取代基具有更强的电子供能能力，可将 Abs/Em_max 分别提高到 553/578 纳米和 580/600 纳米，而1,4-二乙基-十氢-喹喔啉（DQ）则是更强的电子给体，可将 Abs/Em_max 红移至 588/656 纳米。另一方面，降低受体基团的电子密度，如在特定位置引入苯甲酸等强吸电子基团，同样能有效增强分子内的电荷转移（ICT）效应，导致光谱的红移。

此外，扩展共轭π结构是另一种实现荧光团光谱红移的有效方法。这主要通过延长共轭链或引入更多的共轭π单元来实现（图3b.）。例如，在花菁骨架中，将骨架延长一个乙烯基，可导致光谱红移约 100 纳米。  经典三甲川染料（Cy3）的 Abs/Em_max 在可见光区域（CH₂Cl₂ 中为 590/626 nm可能有误，常规Cy3的吸收和发射应该在550/570 nm左右）。五甲川染料（Cy5）比 Cy3 多一个乙烯基，其 Abs/Em_max 在红移到了650/670 nm。在此基础上，又开发出了波长更长的七甲川染料（Cy7）等 。值得注意的是，通过在荧光团末端引入更多共轭苯环等结构，可以进一步扩展分子内的π系统，从而实现更大程度的光谱红移。这一策略在IR-1048和Cy-PA等荧光团上得到了成功应用，其吸收与发射最大值均超过了1000纳米，展现出了优异的性能。

图 3 荧光团红移光谱的化学方法。(a) 调节分子内电子（或推拉）效应。(b) 扩大共轭 π 结构。(c) 染料杂化。(d) 引入杂原子。(e) 染料红移光谱的协同策略。

染料杂化作为光谱红移的有效策略之一，其核心在于通过结合不同染料的共轭π结构，实现光谱特性的优化与扩展。具体而言，半花菁染料（如HD和CS染料）的成功开发，便是基于花菁与吡喃素、罗丹明或荧光素等母体染料的巧妙融合，显著延长了染料的吸收与发射最大波长（Abs/Em_max）。这一方法的精髓在于，它不仅能够独立实现光谱红移，还能与电子效应调节及共轭π结构扩展策略相辅相成，共同推动染料光谱向更长波长区域移动。例如，通过调整供体基团的电子密度（如从单乙基氨基到二乙基氨基，再到久洛尼定的递进），以及引入如萘环等共轭单元，均可进一步增强光谱红移效果。

另一方面，引入杂原子也是实现荧光团光谱红移的重要途径。这一策略基于杂原子σ* 轨道与荧光体π* 轨道间的σ*-π* 共轭作用，有效稳定了LUMO能级，进而促使Abs/Em_max向深红色乃至近红外区域移动。具体而言，使用电子给予性较弱的原子（如第14族元素C、Si、Ge，第15族元素P，以及联属元素S、Se、Te）替代氧，是实现这一目标的常用手段。例如，Drexhage团队通过引入季碳构建了首个C-吡喃罗丹明，而Qian及其同事则进一步设计出了硅吡罗宁，均实现了光谱红移的显著增强。

值得注意的是，上述策略不仅局限于特定染料体系，而是具有广泛的适用性。例如，在罗丹明染料中引入查耳酮类杂原子（S、Se、Te）生成异构罗丹明染料，或利用砜、膦酸盐等强吸电子基团取代桥接氧，均可有效推动Abs/Em_max向近红外区域移动。此外，这些策略还被成功应用于NBD、香豆素等其他染料骨架，创造出了一系列光谱红移的荧光团。

3.2 提高有机荧光团的亮度

在追求成像信号清晰度与生物组织友好性的双重目标下，提升荧光团的亮度成为了荧光探针设计与开发领域的核心议题。高亮度的荧光团不仅能够显著缩短曝光时间或降低激光功率，从而减轻对生物样本的光毒性及背景干扰，还在超分辨率成像、单分子追踪等前沿成像技术中展现出巨大的应用潜力。因此，优化荧光量子产率和摩尔消光系数，进而增强荧光团的整体亮度，已成为当前研究的热点。

针对聚甲基骨架类荧光团（如花菁和方酸衍生物），其固有的低量子产率问题主要归因于激发态下的反式-顺式多烯旋转，这一过程以非辐射方式耗散了大量能量。为了克服这一限制，科学家们探索了多种策略来限制染料在激发态的构象变化，从而有效提升其量子产率（图4a）。例如，Cooper团队在2004年通过引入6元环结构至三甲川染料的聚甲基桥中，成功限制了其构象自由度，实现了量子产率的显著提升（图4a）。随后，Schnermann等人在2017年进一步优化了合成路径，利用环化级联策略构建了构象受限的五甲川染料，其量子产率和荧光寿命均较传统Cy5型荧光团有了质的飞跃（图4a）。

值得注意的是，尽管上述策略在Cy5及类似荧光团上取得了显著成效，但在尝试将其应用于Cy7等更长波长荧光团时，量子产率的提升幅度却相对有限。这一发现提示我们，对于不同结构的荧光团，影响其量子产率的关键因素可能不尽相同。因此，在开发新型高亮度荧光团时，需要针对具体结构特点进行深入的机制研究与策略优化。

图 4 提高荧光团亮度的化学方法包括(a) 限制构象变化。(b) 提高水溶性，平衡阳离子电荷，构建荧光团-抗体共轭物。(c) 抑制 TICT 的形成。 (d) 迫使荧光团更加平面化，以提高摩尔消光系数。

在探讨荧光团性能优化策略时，我们深入分析了π-π堆叠相互作用对荧光团水溶性及光物理特性的影响。此类相互作用常导致水溶性不足，进而诱发荧光团自聚集现象，显著降低了其消光系数与量子产率。为应对这一挑战，科学家们引入了多种亲水基团，包括离子取代基（如阴离子取代基——羧酸、磺酸、膦酸，以及阳离子铵取代基）与非离子取代基（如聚乙二醇（PEG）、聚甘油（PG）树枝状基团、环糊精和树枝状碳水化合物衍生物），这些策略显著提升了染料的水溶性，在生理环境中有效增强了荧光亮度。例如，相较于传统的Cy7染料，含有多个阴离子及非离子取代基的七甲基花菁染料展现出了更优的水溶性和更高的亮度。

近期，Chan团队在偶氮-BODIPY结构中巧妙融入了亲水性葡萄糖分子，不仅大幅提升了染料的水溶性（通过水油分配系数LogD量化，显示出显著改善），还伴随着消光系数与量子产率的双重提升。此外，Smith团队则创新性地设计了一种三维结构，通过在介芳基取代基上安装PEG亲水臂，有效屏蔽了刚性疏水核心，缓解了染料间的自聚集现象，进而提升了染料的消光性能，并成功应用于构建高性能的近红外II荧光团。

然而，在蛋白质标记领域，荧光团在蛋白质表面或细胞器上的非特异性聚集成为制约标记亮度和精度的关键因素。Schnermann等通过系统研究，提出将具有近零净电荷的荧光团与抗体偶联技术相结合，有效缓解了这一问题，同时提高了标记的特异性和亮度。他们还探索了通过C4′-O-烷基取代C4′-苯酚来增强花菁染料与硫醇的反应电阻率的新途径，这一平衡分子电荷的策略也被成功拓展至其他染料骨架，如吉布斯团队设计的ORFluor染料系列，展现了更高的溶解度和亮度，同时保持了良好的细胞膜渗透性。

值得注意的是，新型染料对环境电荷展现出优异的荧光稳定性，能够抵抗亚细胞结构的非特异性结合，为定量成像提供了有力工具。此外，提升水溶性还深刻影响了染料的代谢路径，为探索代谢相关疾病及器官损伤机制开辟了新视角。

针对传统荧光团（如罗丹明、香豆素等）在极性溶剂中易形成TICT（扭转分子内电荷转移）态，导致量子产率降低的问题，科学家们提出了多种解决方案。TICT的抑制关键在于提升电子供体的空间位阻及降低其电子给予能力，从而增加转化为TICT状态的能垒。例如，Lavis团队采用氮杂环丁烷取代罗丹明的二烷基氨基，显著提高了旋转能垒，有效抑制了TICT的形成，同时保持了染料的其他光物理与生物特性。这一策略随后被广泛应用于多种荧光团的改性，包括香豆素、萘酰亚胺等，推动了高性能荧光团的设计与合成。

综上所述，通过引入亲水基团、优化分子结构、平衡电荷分布以及抑制TICT形成等策略，科学家们成功提升了荧光团的水溶性、亮度及稳定性，为生物医学成像、疾病诊断与治疗等领域的发展提供了强有力的支持。 在深入探讨荧光团性能优化的策略时，肖、刘、杨及其研究团队独辟蹊径，选择在二烷基氨基结构中引入季哌嗪分子，以此作为抑制TICT（扭转分子内电荷转移）形成的新颖途径。季哌嗪基团凭借其独特的感应效应，有效降低了相邻氨基的电子供能强度，从而显著提高了TICT形成的能垒，这一创新方法不仅显著改善了罗丹明染料的亮度，还展示了其在萘酰亚胺、NBD和BODIPY等多种荧光团中的广泛适用性。

与此同时，郭晓东团队则采用了另一种策略，即在罗丹明及其他类型荧光团中引入具有强夺电子能力的砜基团。这一策略同样取得了显著成效，通过降低烷基氨基的电子负载能力，实现了荧光团亮度的进一步增强。值得注意的是，拉维斯团队还利用次生同位素效应，通过氘（D）取代氢（H）原子的方法，进一步提高了荧光团的量子产率，尽管这些方法在提升亮度的同时，也伴随有吸收和发射光谱的低色度偏移，这在一定程度上限制了其广泛应用。

除了上述通过抑制TICT形成或改变电子负载能力来提升亮度的策略外，科学家们还探索了另一种途径——即通过提高摩尔消光系数来增强染料亮度。这一策略的关键在于优化荧光团的平面度，因为荧光团的平面度与其消光系数密切相关，平面度越高，消光系数往往越大。

为此，Suzuki团队在2008年率先报道了一种创新方法，即在BODIPY染料的π系统中引入杂芳基（如呋喃），成功增加了荧光团的平面度，并使其消光系数提升了2-3倍。他们进一步通过引入不同电子供体，在保持高消光系数的同时，精确调控了染料的吸收和发射最大值。随后，Chan团队在2019年也取得了重要进展，他们通过在偶氮-BODIPY染料中引入环己烷，设计了一系列对抗性受限荧光团，这些荧光团相较于其母体染料展现出了更高的消光系数。

综上所述，通过引入特定基团以抑制TICT形成、改变电子负载能力或优化荧光团平面度等策略，科学家们成功地实现了荧光团亮度的显著提升。这些研究成果不仅丰富了荧光团的设计与合成理论，也为生物医学成像、材料科学等领域的发展提供了强有力的支持。

3.3 提高有机荧光团的稳定性

在先进成像技术与复杂生物医学成像应用的广阔领域中，特别是在针对生物大分子进行长期成像与追踪时，荧光团的高光稳定性成为了不可或缺的关键性能之一。这是因为，荧光团在持续激光照射下极易遭受光漂白或光胶化等不利效应，这些过程会直接导致信号强度的衰减、空间分辨率的下降以及图像伪影的产生，严重干扰成像结果的准确性和可靠性。

尽管科研界已对光漂白机制进行了广泛研究，但其全面理解仍是一个待解之谜。在众多光漂白途径中，三重态机制已被广泛认可并深入探讨。为了有效减轻荧光团的光漂白现象，科学家们提出了多种策略，其中主要包括：在荧光团结构的战略位置引入电子撤回基团（EWGs）、精心屏蔽易与单线态氧（¹O₂）及其他活性氧物种（ROS）发生反应的区域、以及在荧光团体系中掺入小分子三重态淬灭剂（TSQs）以缩短三重态寿命。

特别地，通过在荧光团结构中巧妙引入EWGs，可以显著降低其电子密度，进而削弱荧光团与¹O₂及ROS之间的反应活性，从而增强光稳定性。以香豆素染料为例，Kuznetsova和Kaliya的研究揭示了7-二乙氨基-4-甲基香豆素中富电子甲基的光依赖性氧化过程，该过程生成了有害的自由基和过氧化物中间体，最终导致染料分子的降解。为了克服这一缺陷，杰克逊团队采用抽电子的三氟甲基取代富电子甲基，显著提升了香豆素染料的光稳定性。

基于这一发现，Sun及其同事进一步将EWG策略应用于荧光素分子，通过在2′和7′位置引入氟原子，成功地将荧光素的光稳定性提升至传统荧光素的两倍。随后，该策略被成功拓展至花菁染料领域，开发出了一系列含有氟原子的新型荧光团，这些荧光团展现出了更为优异的光稳定性，如含有氟原子的70号染料相较于其前驱体69号染料，在光稳定性方面有着显著提升。

综上所述，通过引入EWGs、屏蔽ROS反应位点以及添加TSQs等策略，科学家们正在不断探索并优化荧光团的光稳定性，以满足先进成像技术与复杂生物医学成像应用中对长期、稳定成像的迫切需求。

图 5 提高荧光团稳定性的化学方法。(a) 香豆素染料光漂白和光胶化的具体产物和机理。(b) 引入 EWG 以降低电子密度。 (c) 花菁染料光漂白的具体产物和机理。(d) 在荧光团中加入 TSQ，以减少 T 1 状态的出现。(e) 抑制自由基的形成，避免α-质子化，以缓解光漂白。参考文献 [62] 授权转载。[62].版权所有 2021 年美国化学学会。(f) 用大分子屏蔽活性位点以提高化学/生物稳定性。

在深入探讨荧光团在先进成像技术中的稳定性挑战时，我们不得不关注其光稳定性和化学/生物稳定性两大核心要素。特别是在生物大分子的长期成像与追踪中，这些稳定性特性显得尤为重要。

光稳定性

光漂白，作为荧光团光不稳定性的一种主要表现形式，其机制复杂且多样。其中，与光敏化单线态氧（¹O₂）的反应是花菁染料光漂白的主要途径之一。Schnermann及其团队的研究揭示了¹O₂能够攻击聚甲基链，形成二氧杂环丁烷加合物，这些加合物随后通过C-C裂解转化为羰基产物，导致染料光漂白。此外，荧光团与亲核物之间的反应也被视为花菁染料光漂白的另一重要途径。Cosa等人的工作详细阐述了这一过程，指出光辐射和系统间交叉（ISC）可将花菁染料转变为三重激发态，进而与溶液中的硫醇酸盐反应生成无发射的Cy-thiol加合物，形成暗态。然而，通过酸催化反应或光诱导硫醇消除，这些暗态加合物可部分再生为发光状态，展现出独特的光开关现象。

为了提升荧光团的光稳定性，科学家们采取了多种策略。其中，利用大分子屏蔽位点增加立体阻碍，以降低荧光团与¹O₂和亲核物的反应活性，是一种有效方法。此外，向溶液中加入小分子三重态淬灭剂（TSQs），如1,3,5,7-环辛四烯（COT）、4-硝基苯甲醇（NBA）等，也能显著减少T₁态的发生，进而抑制¹O₂的生成，缓解荧光团的瞬时暗态。然而，高浓度的TSQs需求限制了其在活细胞成像中的应用。为此，研究者们开发了将TSQs与荧光团共价连接的方法，如Blanchard和Chen等人的工作，成功提高了Cy5和Cy3等荧光团在脱氧溶液中的光稳定性。

化学/生物稳定性

与光稳定性不同，荧光团的化学/生物稳定性关乎其在细胞和生物体内抵抗活性物种、亲核物或氨基酸残基（ANRs）破坏的能力。化学/生物稳定性差的荧光团可能因被氨基酸残基裂解而减弱荧光信号，从而限制其在生物大分子长期成像和定量荧光探针构建中的应用。

为了提升荧光团的化学/生物稳定性，科学家们同样采取了多种策略。其中，在荧光团结构的合适位点引入电子撤回基团（EWGs）和用笨重的分子屏蔽活性位点，是两种常见且有效的方法。这些方法通过降低荧光团与¹O₂和其他ROS的反应活性，同时增强其对生物体内环境的抵抗力，从而显著提升其化学/生物稳定性。例如，Yuan及其同事的研究表明，通过苯甲酸屏蔽9位易被ANRs攻击的位点，CS染料相较于HD染料展现出了更高的化学/生物稳定性，并基于此开发了化学/生物稳定的近红外II染料。

综上所述，通过综合运用多种策略，科学家们正不断推动荧光团在成像技术中的稳定性提升，为生物大分子的长期成像与追踪提供更加可靠和高效的工具。

3.4 增加有机荧光团的斯托克斯位移

斯托克斯位移，作为荧光团性能的一个重要指标，定义为最大发射波长与最大吸收波长之间的差值，对于荧光成像的效率和信噪比具有显著影响。传统上广泛应用的荧光团，诸如罗丹明、罗丹醇、BODIPY、噁嗪及花菁类染料，普遍展现出较小的斯托克斯位移（通常小于30 nm），这一特性直接导致其激发光谱与发射光谱的严重重叠。这种重叠现象不仅加剧了荧光自淬灭效应，还显著降低了成像过程中的信噪比，从而极大地限制了这些荧光团在复杂生物成像领域，特别是单激发多色成像技术中的应用潜力。

深入分析传统荧光团电子结构的共性，我们发现其高量子产率往往源自对称的HOMO（最高占据分子轨道）和LUMO（最低未占据分子轨道）轨道分布。然而，这种对称性也削弱了振动子轨道的贡献，使得电子在激发态向低振动态的转换变得困难，进而限制了斯托克斯位移的扩大，导致发射光谱最大值紧邻激发光谱最大值。

为了克服这一瓶颈，科学家们通过引入不对称电子结构，旨在增强HOMO和LUMO轨道的振动贡献，从而诱导内部转换过程，实现斯托克斯位移的有效扩大。袁组和冼组在这一领域取得了突破性进展，他们成功地在罗丹明或罗丹醇染料中嵌入了具有强电子供体特性的1,4-二甲基-十氢-喹喔啉或四氢-喹喔啉基团（如化合物86和88），这些基团赋予了染料不对称的电子密度，促进了HOMO轨道的不对称振动，从根本上将传统染料的对称电子结构转变为具有分子内电荷转移（ICT）特性的新型染料。这一策略不仅显著扩大了荧光团的斯托克斯位移（高达3倍），还通过缩小HOMO与LUMO轨道间的能隙，实现了吸收和发射光谱的红移。

随后，研究者们将这一创新方法推广至罗多、Si-pyronin、噁嗪、方酸及花菁等其他荧光团体系，成功开发出了一系列具有大斯托克斯位移和长波长特性的新型荧光团（如化合物90、92、94、95）。然而，值得注意的是，这种分子修饰在提升斯托克斯位移的同时，也往往伴随着水溶液中亮度的降低，这在一定程度上限制了这些染料在高级成像技术中的直接应用。

为了克服亮度下降的问题，袁隆平及其研究团队进一步优化了分子设计，通过引入具有不同电子推拉效应的取代基，并系统调节四氢喹喔啉分子的电子密度，实现了在保持适当斯托克斯位移（如56 nm）的同时，显著提升荧光亮度的目标。例如，与三氟乙基结合的YL578（化合物96）展现出了比经典染料RhB高出两倍的荧光亮度。

此外，他们还将这种分子设计策略扩展至罗丹醇、香豆素及BODIPY等更多种类的荧光团中，成功构建了一系列在亮度和斯托克斯位移方面均得到显著改善的新型荧光团（如化合物97、99、101）。特别地，含有四氢喹喔啉基团的对称罗丹明（化合物5）及含有杂原子的不对称罗丹明（化合物23、24）也显示出了扩展的斯托克斯位移，这进一步印证了ICT效应或振动弛豫增强对于斯托克斯位移扩大的重要作用。然而，这些荧光团的具体作用机制仍需未来更深入的研究来加以阐明。

图 6 增加荧光团斯托克斯位移的化学方法。(a) 引入不对称电子结构。(b) 在荧光团的中心位置加入氨基。(c) 在荧光团的适当位置引入适用的转子。

在荧光团的设计中，引入特定官能团和结构调整以扩大斯托克斯位移已成为提升荧光性能的重要途径。近年来，研究者们通过一系列创新策略，不仅丰富了荧光团的设计思路，还显著提升了其在生物成像、光电子学等领域的应用潜力。

首先，关于在荧光团中心位置引入氨基的策略，这一方法被证明是有效增加斯托克斯位移的关键手段之一。例如，2005年Peng团队通过将烷基氨基巧妙地置于七氨基氰的中心，成功合成了具有显著斯托克斯位移的新型染料（103）。随后，Burgess等人在2008年进一步将烷基氨基用于罗丹明染料的改性，实现了斯托克斯位移的两倍增长（104），这一成果显著拓宽了罗丹明染料的应用范围。克兰研究团队则深入探索了N原子上取代基的变化对斯托克斯位移的影响，发现通过调整抽电子取代基能够进一步扩展斯托克斯位移（105），并通过理论计算揭示了其背后的分子内电荷转移机制，即HOMO至LUMO轨道的电子跃迁伴随着C9-N键的伸长及溶剂的显著重组，这一发现为设计高性能荧光团提供了重要理论依据。

此外，Guo等人结合中心N原子与振动结构优化的创新思路，成功将Si-罗丹明的发射最大值推向近红外II区，同时显著提升了斯托克斯位移，这一突破不仅丰富了近红外荧光团的设计策略，还为其在生物体内深组织成像中的应用开辟了新途径。值得注意的是，这一策略已被成功扩展至BODIPY等其他荧光团骨架，进一步验证了其普适性和有效性。然而，值得注意的是，虽然这些方法在扩大斯托克斯位移方面表现出色，但往往也伴随着色度位移的降低，这需要在具体应用中权衡考虑。

另一方面，通过在荧光团中引入旋转取代基以增加激发态的立体阻碍和几何弛豫，也是扩大斯托克斯位移的有效策略。以香豆素染料为例，Cole、Xu等人在其3位或4位引入不同取代基后，发现4位取代的香豆素展现出更大的斯托克斯位移，这得益于取代基旋转产生的扭转功被较强的立体阻碍所消耗。这一策略在BODIPY染料中也得到了验证，进一步证明了其在不同荧光团体系中的广泛适用性。

除了上述方法外，研究者们还提出了基于供体-受体能量转移、复合、激发态分子内质子转移、局部激发、TICT（分子内电荷转移态）及溶剂笼弛豫等多种机制来设计具有较大伪斯托克斯位移的荧光团。这些方法虽然对分子骨架有一定的要求，但为实现特定荧光性能提供了灵活多样的设计路径。然而，将这些方法应用于非传统荧光团时仍面临诸多挑战，需要进一步的研究和探索。

综上所述，通过引入特定官能团、调整分子结构以及利用多种物理化学机制，研究者们已经成功开发出多种具有大斯托克斯位移的荧光团，这些成果不仅丰富了荧光团的设计理论，还为推动荧光成像、光电子学等领域的发展提供了有力支持。未来，随着研究的不断深入，相信会有更多创新策略涌现，进一步拓展荧光团的应用边界。

3.5 调节有机荧光团的细胞渗透性

细胞膜，这一由多种脂质双分子层与膜蛋白构成的复杂结构体，不仅是细胞内外环境之间的界面，还承担着调控物质进出、维持细胞稳态的关键角色。在细胞成像技术中，荧光团或探针作为外源性小分子，其首要任务便是穿越细胞膜，实现对细胞内生物大分子的精准标记与高效检测。

鉴于细胞渗透性直接影响荧光团及探针的标记与检测效率，评估并优化这一性质成为了提升成像性能的关键环节。通常，小分子荧光团及探针主要依赖被动扩散机制进入细胞，而此过程的效率深受极性、分子大小及亲油性等特性的影响。

为了预测并优化小分子药物的细胞渗透性，利宾斯基团队提出了著名的“5法则”，该框架基于分子量、氢键供受体数量及logD值等参数，为评估小分子药物的渗透潜力提供了重要依据。尽管存在一定的局限性，该法则仍为科学界预测与优化药物分子设计提供了宝贵的参考。

在荧光团领域，尤其是罗丹明及类罗丹明染料，其独特的螺内酯与荧光齐聚物之间的可逆平衡机制，为调节细胞渗透性提供了新的思路。D50值与KL–Z值作为描述这一平衡的关键参数，直接关联着染料的细胞渗透性能。通过结构改性，如降低杂蒽分子中的电子密度、将羧基转化为酰胺以及应用邻位基团效应等策略，可以有效地调整D50值与KL–Z值，从而增强罗丹明染料的细胞渗透性。

具体而言，降低杂蒽分子电子密度的方法包括使用弱电子给予原子替代桥接氧原子、在特定位点引入共轭电子撤回分子及氟取代氮杂环丁烷等。而将羧基转化为缺电子酰胺的策略，则通过微调染料的平衡状态，显著增强其螺环化作用，进而提升细胞渗透性。此外，利用邻位基团效应稳定螺内酯状态，同样是一种行之有效的改性方法。

图 7 调节荧光团细胞渗透性的化学方法。(a-d）通过结构修饰调节罗丹明染料在疏水性螺内酯和齐聚物状态下的平衡的化学方法，包括降低杂蒽分子中的电子密度（a）、将羧基转化为酰胺（b）、应用邻位基团效应（c）以及在垂苯上共轭氟原子（d）。 (e) 通过引入或屏蔽亲水性氨基或羧基，应用具有生物标记性的乙酰氧基甲基（AM）来屏蔽酸性或羟基取代基，并系统地调节不对称罗丹明的细胞渗透性。

在荧光团的设计与应用中，一个关键挑战在于平衡其光物理性质与生物相容性，特别是当荧光团含有强夺电子桥基（如砜基和膦酸基）时，它们可能倾向于形成疏水性且无荧光的螺内酯状态，这极大地限制了其在细胞成像和蛋白质标记中的荧光强度。

为了克服这一问题，Lavis及其研究团队采取了创新策略，在垂苯结构上共轭氟原子，这一设计巧妙地抑制了螺环化过程，从而有效平衡了罗丹明染料的两种状态，显著改善了其荧光性能（如图7d所示）。

另一方面，尽管引入强极性局部电荷（如羧酸、磺酸、磷酸及季铵等）能够提升荧光团的溶解度和光物理性质，但这种做法往往以牺牲细胞通透性为代价。为了缓解这一矛盾，研究者们开发了极性取代基的酯化或酰胺化方法，以掩盖电荷对细胞通透性的不利影响。特别是，利用生物体内广泛存在的酯酶水解作用，乙酰氧基甲基（AM）等生物标记保护基团被成功应用于将含酸或羟基取代基的荧光团高效递送至细胞内（如米勒团队开发的phophonoflorescein，尽管其原生状态下细胞渗透性差，但通过AM修饰后显著改善了这一性能）。

值得注意的是，酯酶裂解后释放的噬氟荧光素能够稳定存在于细胞内，为长期细胞成像提供了可能。此外，袁志刚及其同事通过精细的氨基乙酰化和羧基酯化调控，不仅优化了不对称罗丹明染料的细胞渗透性，还开发出了一系列对癌细胞具有更高亲和力的荧光团，为癌症诊断与治疗监测开辟了新的途径。

对于细胞外或细胞膜成像而言，则需要选择那些难以穿透细胞膜的荧光团。此时，含有局部电荷的荧光团因其独特的性质而备受青睐。同时，通过引入长烷基链，荧光团或探针能够嵌入细胞膜的磷脂双分子层中，实现对细胞膜的特异性标记与成像，进一步拓展了荧光团在生物学研究中的应用范围。

4 改进型有机荧光团在成像和传感方面的应用

4.1 高信噪比的深层组织成像

光致发光（PL）技术作为生物医学成像领域的瑰宝，为实现生物过程的无创、实时及动态可视化提供了强有力的工具。然而，传统荧光团因激发与发射波长较短（通常小于900纳米），其穿透深度有限，严重制约了深部组织成像的清晰度与信噪比。为了突破这一瓶颈，科学家们巧妙地将光谱窗口拓展至近红外II区（900-1700纳米），并通过精细的结构设计与改性，显著提升了荧光团的亮度、水溶性和光稳定性，从而极大地增强了荧光成像的穿透深度与成像质量。

2015年，Dai、Cheng、Hong及其研究团队在这一领域取得了突破性进展，他们成功合成了基于D-A-D结构的近红外II荧光分子CH1055。为了优化该分子的水溶性并提升其生物相容性，团队巧妙地引入了多种PEG链段（图8a）。CH1055-PEG不仅具备约1055纳米的最大发射波长，展现出卓越的水溶性和通过肾脏快速排泄的特性（24小时内肾脏清除率接近90%），还实现了小鼠淋巴管、血液及深层脑肿瘤（穿透深度约4毫米）的高分辨率无创成像。尤为引人注目的是，CH1055-PEG在肿瘤与正常组织的对比度上较近红外I成像提升了5倍，为图像引导下的精准肿瘤切除手术提供了有力支持。

随后，该团队进一步探索，通过在CH1055中引入磺酰基，创制了水溶性更强的近红外II荧光体CH-4T。CH-4T与血浆蛋白的高效结合，不仅大幅提升了其亮度，还实现了对心脏跳动周期的超高速动态成像。与此同时，Zhang及其同事则以蓝蛋白骨架为基础，精心构建了具有1064/1080纳米激发/发射特性的近红外II染料FD-1080。该染料在穿透深度、成像分辨率及呼吸频率量化分析等方面均展现出显著优势，并通过设计LZ-1105等衍生荧光团，实现了对溶栓、缺血再灌注及血脑屏障动态变化的精准监测。

此外，Sletten及其研究团队也不甘落后，他们开发的PhosphoChem7近红外II荧光团，凭借四个磷酸官能团的引入，不仅实现了极佳的水溶性，还因这些官能团作为钙离子结合模块的功能，赋予了该荧光团在清醒、移动小鼠体内进行骨骼成像的独特能力。

综上所述，随着近红外II区荧光团技术的不断发展与创新，其在生物医学成像领域的应用前景日益广阔。从淋巴管、血液成像到深层组织病变的精准识别，再到心脏、血管及骨骼等复杂生理过程的动态监测，这些荧光团正逐步成为推动生物医学研究进步的重要力量。同时，基于花菁、D-A-D结构及其他先进设计的近红外II造影剂与改性染料，也在持续拓展着单色近红外II成像的边界，为生命科学探索开启了新的篇章。

图 8 改进型荧光团在深部组织成像中的应用。(a) CH1055-PEG 和 CH-4T 的结构。 (b) 注射 ICG 后的近红外-I 荧光图像（左下）和注射 CH1055-PEG 后的近红外-II 荧光图像（左上），显示腹股沟淋巴结和淋巴管；注射 CH1055-PEG 后 24 小时的全身近红外-II 荧光成像（中上）；使用 CH1055-PEG 通过剃光头的小鼠头皮和颅骨进行脑血管近红外-II 成像（中下）；小鼠注射 PEG-affibody 24 小时后，在进行近红外-II 荧光图像引导手术切除肿瘤前后的图像（右）。 (c) 在超快 50 FPS 成像过程中注入 CH-4T/FBS 加热后 2 秒钟的近红外-II 荧光图像。 插图：注射后 3 秒内股动脉上集成 ROI 区域的荧光强度，显示出清晰可辨的心动周期。(d) FD1080 和 LZ1105 的结构。 (e）在 1064 纳米的激发下，通过检测注射 FD1080-FBS 复合物的小鼠肝脏运动产生的信号波动，观察清醒（上图）和麻醉（下图）小鼠的呼吸频率。(f) 实时无创 NIR-II 成像监测小鼠注射 LZ-1105 后血脑屏障（BBB）的开放和恢复情况。(g) PhosphoChrom7 的结构和一只注射 PhosphoChrom7 的小鼠切除腹部器官和大部分皮肤后的背视荧光图像。 (h) MeOFlav7、JoloFlav7 和 ICG 的结构。(i) 成像实验中所用染料的吸收曲线与激发波长的对比图。(j) 使用 785、980 和 1,064 纳米激发波长的多重活体图像。(k) ECXb、ECYS2 和 EC7 的结构。(l)808nm波长通道中的ECYS2（肠）、930nm波长通道中的ECXb（胃）以及1064nm波长通道中的EC7（血管）荧光图像。

多色成像技术，作为生物医学成像领域的一项重大进展，相较于单色成像而言，其独特的优势在于能够同时捕获多个生物大分子或复杂生物结构的实时信息，这对于深入理解细胞及生物体内的复杂生理与病理过程具有不可估量的价值。2020年，Sletter、Bruns及其研究团队在Flav7染料的基础上，开展了深入的探索，他们系统地研究了染料分子7位上不同基团对其光物理性质的微妙影响，并据此构建了一系列性能各异的黄钇聚甲胺染料，这些染料展现出了多样化的激发与发射光谱特性（如图所示）。

为了将这一研究成果应用于体内多色成像，研究团队进一步设计并搭建了一套先进的近红外/西红外多通道激发、单通道检测的成像系统。通过精心匹配MeOFlav7、JoloFlav7和ICG等染料与980nm、1064nm和785nm的激光器，他们成功实现了具有卓越时间空间分辨率的实时三色活体成像，这一技术突破为生物体内复杂动态过程的可视化提供了强有力的工具（图Ⅳ所示）。

随后，研究团队并未止步，他们继续在Flav染料支架上深耕细作，探索了2位上不同取代基对染料光物理性质的调控作用，并成功合成了多种性能独特的铬基聚甲醛染料。在此基础上，他们巧妙地结合ICG、JoloChrom5、Chrom7和JuloFlav7等染料与特定波长的优先激发激光器（785nm、892nm、968nm和1065nm），实现了无创、实时且高对比度的四色体内成像，进一步拓宽了多色成像技术的应用范围。

与此同时，在罗丹明染料骨架的基础上，Yang等人通过一系列创新性的设计策略，包括替换中心原子、精细调节电子密度以及扩展共轭体系等，开发出了一系列具有高亮度、多样化激发与发射光谱特性的近红外II区荧光团——EC染料系列（如图）。这些荧光团不仅克服了传统荧光团在深部组织成像中的穿透深度限制，还展现出了优异的生物相容性和稳定性。最近，他们利用808nm、930nm和1064nm的激光分别激发ECYS2、ECXb和EC7等染料，成功实现了活体小鼠肠道、胃及血管系统的三色成像，为生物医学研究提供了更加丰富的可视化信息（图示）。

此外，通过巧妙地结合其他具有不同激发与发射光谱特性的染料分子，研究者们还实现了更为复杂的多色成像体系，包括双色、三色乃至更多色的活体成像，这些技术的不断创新与发展，正逐步推动着生物医学成像领域向更加精细化、多维化的方向迈进。

4.2 Protein labeling

Figure 9

改进型荧光团在蛋白质标记中的应用。(a) 常见标签的结构，包括 CLIP-标签、S_nAP-标签、Halo-标签、TMP-标签、四氮嗪、jasplakinode（靶向肌动蛋白）、docetaxel（靶向微管）和 pepstain（靶向溶酶体）。(b) SiR 标记的结构。 (c）用 SiR-S_nAP 对大鼠大脑进行体内外标记（左上）；用 SiR-tetrazine 对基因编码的 UAAs 进行位点特异性标记（左下）；皮层 1 中 YFP 标记的轴突和树突的荧光图像，这些轴突和树突被用作随时间追踪 SiR-Halo 配体点的靶点（右图）。 经参考文献 [92] 和 [110] 授权转载。[92] 和 [110]。版权 2013 Springer Nature 和 2022 Elsevier Inc. (d) SiR700-tag 的结构。 (e）用 SiR-tubulin（绿色）和 SiR700-actin（红色）染色的人类原代成纤维细胞的双色 SIM 纳米镜（上）；用 SiR-tubulin（绿色）和 SiR700-lysosome（黄色）染色的活体人类原代成纤维细胞的双色 STED 纳米镜（下）。 (f) CX-TPP 的结构（上图）；用于同步多色成像的染料 Alexa Fluor 488（黄色）、CX（品红色）、580CP（绿色）和 GeR（青色）的归一化吸收和发射光谱、相关激光线（垂直实线）和检测窗口（透明矩形）。 去激发激光（黑线）的波长为 775 nm（中间）；用于四色成像的激发/检测方案（左下）；用 580CP-肌动蛋白、GeR-微管蛋白和 CX-TPP 染色的活体大鼠海马神经元的四色图像，然后用抗神经鞘磷脂和抗小鼠 Alexa Fluor 488 标记（右下）。 (g）JF646-Halo 和 JF635-Halo 的结构。 (h）转染了 H2B-HaloTag 的活 HeLa 细胞，与 SiR-Halo（左上）或 JF646-Halo（左下）孵育后的广域荧光显微镜图像，成像过程中无中间洗涤步骤；在 "盆地 "神经元（BNs）中表达肉豆蔻酰化 HaloTag 蛋白并用 JF635-Halo 染色的果蝇三龄幼虫中枢神经系统的 SiMView 光片显微镜图像（三维投影）（右图）。(i) YL578-Halo 的结构。 (j) STED图像中用CPY-Halo、JF608-Halo、580CP-Halo和YL578-Halo标记的波形蛋白丝的归一化荧光强度与帧数的函数关系图。 (k）用YL578-Halo标记的表达Tomm20-Halo的U2 OS细胞线粒体的三维STED图像（左）；用YL578-Halo（红色）、MaP555-肌动蛋白（青色）和GeR-tubulin（绿色）标记的活体U2 OS Vimentin-HaloTag表达细胞的三色共聚焦和STED图像（右）。 转载自参考文献[83]。[83].Copyright 2022 Springer Nature.(l) RhO110-Halo 和 MaP510-Halo 的结构。(m）在存在和不存在 HaloTag 蛋白的情况下测量的 MaP-Halo 的吸收和发射光谱。 (n）共培养的正常 U2 OS 细胞和用 RhO110-Halo（左）或 MaP510-Halo（右）标记的 U2 OS FlpIn Halo-S_nAP-NLS 表达细胞的免清洗活细胞共聚焦图像。经参考文献 [5c] 授权转载。[5c].Copyright 2020 Springer Nature.

蛋白质，作为生命活动的基本执行者，广泛参与细胞内的各种复杂过程，包括定位、迁移、相互作用以及构象变化等。为了深入解析这些动态过程，科学家们开发了多种先进的分析技术，其中，蛋白质标签技术凭借其独特的优势，在蛋白质研究中占据了举足轻重的地位。这项技术通过将特定的原生蛋白质、标签蛋白质或人工修饰的蛋白质与多功能荧光团巧妙地结合，不仅简化了实验流程，还极大地提高了标记的灵活性和准确性。

在蛋白质标签的广阔天地中，基因编码标签（如CLIP-tag、S_nAP-tag、Halo-tag、TMP-tag）、天然高亲和力配体（如针对F-肌动蛋白的jasplakinolide、针对微管的docetaxel）以及非天然氨基酸标签（如四氮嗪）等构成了其核心成员。这些标签各具特色，为不同的研究需求提供了多样化的选择。值得注意的是，为了实现高质量的标记效果，所选用的荧光团必须具备高亮度、优异的光稳定性以及良好的细胞膜穿透性。

以改进型罗丹明染料为例，近年来科学家们在这一领域取得了显著进展。Johnsson团队于2013年成功合成了Si-罗丹明（SiR），并基于这一平台开发出了一系列远红外蛋白质标签（如SiR-S_nAP、SiR-CLIP、SiR-Halo、SiR-tetrazine），这些标签在蛋白质成像领域展现出了巨大的应用潜力。例如，SiR-S_nAP被成功应用于大鼠大脑的体外标记，SiR-tetrazine则实现了大肠杆菌活细胞中基因编码非天然氨基酸的位点特异性标记。此外，SiR-Halo还被用来量化兴奋性突触中内源性突触蛋白PSD95的寿命，为神经科学研究提供了新视角。

为了进一步拓展荧光标记的应用范围，研究人员在SiR的基础上引入了吲哚啉，从而开发出具有近红外激发和发射特性的SiR700染料，并构建了相应的蛋白质标签（如SiR700-actin、SiR700-S_nAP等）。这些标签不仅能够在共聚焦显微镜和STED显微镜下实现对两种蛋白质的同步标记和成像，还为研究蛋白质间的相互作用提供了强有力的工具。

此外，大斯托克斯位移荧光团的出现也为多色成像技术带来了新的突破。Hell团队基于此类荧光团开发了多种标记物，成功实现了活体人成纤维细胞和活体大鼠海马神经元中多种蛋白质的四色成像。同时，Lavis团队在JF染料基础上开发的亮标签也以其卓越的信噪比表现赢得了广泛关注。JF635-Halo标签已被成功应用于果蝇幼虫活体脑组织的成像研究中。

为了提高荧光标记的亮度和光稳定性，袁、王等科学家设计了新型荧光标签YL578-Halo。该标签在亮度和光稳定性方面均优于传统染料，并成功应用于线粒体导入受体蛋白Tomm20的三维STED成像中。为了进一步减少非特异性结合导致的背景荧光并提高信噪比，Johnsson、Wang等团队还开发了多种新型蛋白质标签，并通过分子对接与筛选技术实现了对Halo-tag的可逆标记，显著提高了荧光标记的光稳定性和可视化时间。

4.3 生物传感

荧光探针技术作为现代生物科学中的一项关键工具，其应用范围已广泛覆盖至细胞和生物体内生物大分子含量变化的实时监测，这些生物大分子涵盖了活性小分子、酶、气态信号分子以及微环境参数等。荧光探针的构建核心在于将生物大分子的特异性识别位点与荧光团的光学可调性位点巧妙地共轭结合，这种设计使得分子内电荷分布的显著变化能够直接转化为荧光信号的淬灭或光谱特征的偏移，从而实现对目标分子的灵敏检测。

然而，传统荧光团在性能上的局限性，如荧光量子产率不足、光稳定性差等，限制了荧光探针在复杂生物体系中的广泛应用。为此，科学家们不断探索并开发出基于改进型荧光团的新型探针，以满足日益增长的生物传感需求，特别是在疾病标志物检测、药物代谢监测等领域展现出巨大潜力。

4.3.1 活性小分子与酶的检测

近年来，荧光团HDs（一种融合了氰素与荧光素/吡咯宁结构的创新产物）凭借其优异的光学性能、简便的合成路径以及可调的荧光特性，在活化近红外荧光探针的设计中占据了重要地位。这些探针被广泛应用于检测多种与疾病密切相关的生物标记物，如活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性硫（RSS）及特定酶活性等。通过系统总结基于HDs探针的设计策略与应用实例，研究人员不断深化了对这一领域的认识。

此外，Yuan团队在化学性质稳定的CS染料基础上，成功构建了一系列可激活的荧光探针，这些探针能够精准识别并检测包括亮氨酸氨肽酶（LAP）、亚硝基还原酶（NTR）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、过氧化亚硝酸盐（ONOO⁻）及超氧阴离子（O₂⁻）在内的多种疾病相关生物标志物。这些探针不仅实现了对药物诱导的肝/肾损伤的高保真评估，还展示了在特异性肿瘤成像中的卓越性能。

为了进一步拓展成像深度和信噪比，Yuan团队还通过扩大共轭体系及引入强电子负载基团，设计了一系列具有光学可调羟基的近红外II区（NIR-II）染料（NIRII-HDs）。基于这些染料，他们合成了三种活化的NIR-II探针，分别用于检测ONOO⁻、谷胱甘肽（GSH）及碱性磷酸酶（ALP）。其中，NIRII-HD5-ONOO⁻探针在LPS诱导的淋巴炎症及转移性肿瘤诱导的前哨淋巴结的体内成像中表现出色。

值得注意的是，通过用硫原子替代HDs中的桥接氧原子，不仅能够实现光谱的红移，还能有效平衡染料的荧光与光声（PA）成像性能，显著提升探针在PA成像中的灵敏度。基于这一策略，Chan、Chen及Shen等研究团队分别开发了多种以S-HDs为荧光团的可活化探针，用于体内疾病生物标志物的监测，如β-半乳糖苷酶、NTR及H₂O₂等。其中，PA-HD-H₂O₂和AS-Cy-NO₂探针分别在阿尔茨海默病小鼠模型及肿瘤生物标志物的高质量PA检测中取得了显著成果。

图 10

改进型荧光团在生物传感中的应用。(a) NIR-O 2 − 、NIR-β-Gal-2、NIR-LAP、NIR-ONOO − 和 NO 2 -CS 的结构。(b) BALB/c 小鼠接受生理盐水（对照组）、单独 APAP 或与 GSH 一起接受 NIR-LAP 后的代表性图像（左）；（b）中的相对荧光强度（右）。 (c) NIRII-HD5-ONOO − 、NIRII-HD5-GSH 和 NIRII-HD5-ALP 的结构（上图）；使用 NIRII-HD5-ONOO- 探针对 LPS 诱导的淋巴炎症进行示意图和 NIR-II 荧光成像（下图）。(d) PA-HD-Gal、PA-HD-H 2 O 2 和 AS-Cy-NO 2 的结构（左上）。阿尔茨海默病小鼠和野生型小鼠在 PA-HD-H 2 O 2 2.5 小时后大脑的代表性光声图像（下图）；阿尔茨海默病小鼠和野生型小鼠的光声开启响应（右上图）。 (e) MRPS₁-3 的化学结构及其对各自生物标志物（MRP1 为 O2⋅ − ，MRP2 为 NAG，MRP3 为 caspase-3）的活化形式。 (f) APNO-1080 与 NO 反应生成 N-亚硝基产物（上图）；4T₁-Luc 肿瘤的代表性 PA 图像，以及 APNO-1080 治疗后的无瘤对照（下图）。 (g) 对位 phosVF2.1Cl 的结构（左）；用对位 phosVF2.1Cl 染色的 HEK 细胞（中）；在全细胞电压钳模式下，单个 HEK 细胞在超极化和去极化步骤中，对位 phosVF2.1Cl 的荧光变化分数与时间的关系图（右）。

在生物医学研究领域，针对疾病相关生物标记物的精准检测一直是科学家们关注的焦点。尽管现有探针在检测这些标记物方面展现出了卓越的性能，但在靶向特定器官（尤其是肾脏）进行成像时，却面临着显著的挑战。为了克服这一难题，研究者们创新性地提出在荧光染料中融入水溶性分子，这一策略不仅有效避免了染料在水溶液中的自聚集现象，从而显著提升了荧光亮度，更重要的是，它巧妙地改变了染料的代谢路径，使其能够顺利经由肾脏排出，赋予了探针独特的肾脏靶向成像能力。这类经过特殊设计的共轭分子，在学术界被赋予了“肾脏可清除光学剂”（RCOA）的称谓，其重要性不言而喻。

在探索RCOA的应用过程中，多种水溶性分子如菊粉、山奈素、环糊精、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）以及聚乙二醇（PEG）等，因其优异的溶解性和生物相容性而被广泛采用。特别是Pu及其研究团队，在这一领域取得了具有里程碑意义的研究成果。2019年，他们巧妙地将高水溶性（2-羟基丙基）-β-环糊精（HPβCD）与HDs荧光团相结合，成功合成了肾清除荧光团（CCD）。这一创新不仅为后续的探针设计奠定了坚实的基础，更激发了研究者们对RCOA无限潜力的探索热情。

基于CCD平台，Pu团队进一步构建了三种高度特异性的可激活探针（MRPs），这些探针分别针对超氧阴离子（O₂⋅−）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）以及caspase-3等关键生物标记物进行检测。通过应用这些MRPs，他们成功实现了对药物诱导急性肾损伤的早期诊断，为临床治疗和干预提供了宝贵的窗口期。

与此同时，Huang及其同事也在RCOA领域取得了显著进展。他们设计并合成了多种新型RCOAs，这些探针在监测和评估早期急性肾衰竭方面展现出了卓越的性能，进一步拓宽了RCOA在肾脏疾病诊断中的应用范围。

为了更全面地总结RCOA的研究进展，Pu小组于2021年发表了一篇详尽的综述文章。该文章不仅系统梳理了RCOA的设计原理、合成策略及优化方法，还深入探讨了其在生物医学领域的潜在应用和未来发展方向，为后续的科研工作提供了宝贵的参考和指导。

4.3.2 气体信号分子的检测

在生物学领域中，一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）及硫化氢（H₂S）等气态信号分子扮演着至关重要的角色，它们深度参与并调控着生物体内的多种信号传导路径，对维持生理稳态及疾病的发生发展具有不可忽视的影响。为了精准捕捉这些气态信号分子的动态变化，科学家们开发了荧光探针这一强大的分析工具，该工具已广泛应用于揭示这些分子的生理及病理功能，为疾病诊断与治疗策略的制定提供了重要依据。

近年来，随着荧光探针技术的不断进步，研究者们通过优化荧光团的结构设计，为探测气态信号分子的探针开发开辟了新的路径。一个典型的例子是在荧光团的中心位置引入氨基基团，尽管这一策略在某些情况下可能引发低色度偏移并增加斯托克斯位移，但通过精细的结构改造或巧妙的化学反应来屏蔽氨基，可以有效地逆转这些不利影响，从而提升探针的性能。

值得关注的是，2021年Chan及其研究团队在这一领域取得了显著成果。他们创新性地在IR-26、IR-1061、IR-1048、Et-1080及Flav7等荧光团中引入了对甲氧基苯胺，成功合成了一系列具有短吸收特性的探针。这些探针能够特异性地与NO发生反应，并转化为N-亚硝基产物，其吸收波长位于近红外II区，这一特性使得它们在生物组织中的穿透能力更强，成像效果更佳。特别是他们利用APNO-1080探针，实现了对乳腺癌深部组织的正位成像，为癌症的早期诊断提供了有力支持。

此外，Guo等人也基于具有大斯托克斯位移的杂蒽染料，开发出了两种新型探针，这些探针不仅能够有效检测汞离子（Hg²⁺）和氮氧化物，还能够在阿尔茨海默氏症小鼠模型中实现对氮氧化物波动的原位跟踪。这一研究成果不仅加深了我们对神经退行性疾病发病机制的理解，也为相关疾病的早期诊断与干预提供了新的思路。

4.3.3 监测微环境变化

在生物体内，蛋白质、细胞器及器官的高效运作依赖于一个精心调控的微环境，这一环境对维持其正常的生理功能至关重要。微环境的稳态一旦遭受破坏，往往会导致细胞内催化活性的下降或整体功能的障碍，进而可能触发一系列的生理紊乱和疾病过程。因此，精准且实时地监测微环境中的多种参数变化，如pH值、温度、极性、粘度、氧合状态、膜电位以及膜张力等，对于深入理解微环境调控的生理病理机制具有不可估量的价值。

为了满足这一需求，科研界已开发出一系列高度专业化的荧光探针，这些探针能够精准捕捉并报告微环境的微妙变化。以膜电位监测为例，膜电位作为细胞的一个基本且独特的生物物理特性，其稳定与否直接关系到细胞的正常生理功能。为此，米勒及其研究团队通过不懈的努力，设计出了一系列基于改良型罗丹明和荧光素染料的电压敏感型荧光指示剂（VoltageFluors）。这些创新性的指示剂通过巧妙地将亲脂性且富含电子的分子线与荧光团融合，成功实现了对细胞膜的有效定位，并借助光诱导电子转移（PeT）机制实现了荧光的动态调控。

具体而言，当膜处于静息状态时，PeT过程会导致染料的荧光被有效淬灭；而一旦膜电位发生变化，如发生去极化，这一过程将被抑制，从而使得荧光信号得以恢复并增强。这种基于电子运动的荧光变化机制，使得电压荧光染料能够精确捕捉到膜电位的细微波动，且其检测效果高度依赖于电子在激发态发色团产生荧光之前的有效拦截。

米勒团队的研究成果不仅丰富了我们对膜电位监测技术的理解，更为该领域的未来发展奠定了坚实的基础。特别是在2020年，他们发表了一篇详尽的综述文章，对该类指示剂的设计原理、合成策略及应用前景进行了全面梳理和总结。而到了2021年，他们更是再接再厉，通过引入水溶性更佳的膦酰荧光素作为共轭分子，进一步优化了电压荧光探针的性能，实现了对膜电压更加精准且高效的检测（如图10g所示）。这一突破不仅为细胞膜电位研究提供了新的有力工具，也为相关领域的深入研究开辟了新的可能。

5 总结与展望

在探索微观分子机制与宏观病理学的广阔领域中，先进荧光成像技术的涌现成为了推动科学发现的关键力量。然而，传统荧光团因其在吸收和发射波长、亮度、稳定性、斯托克斯位移及生物渗透性等方面的固有局限性，极大地限制了这些技术的应用潜力与科学探索的深度。近年来，科学家们致力于通过创新策略改善罗丹明、罗丹醇、BODIPY、花菁及半花菁等荧光团的性能，以期突破现有瓶颈。

尽管这些改性染料在提升荧光成像质量方面取得了显著进展，使得我们能够更精细地洞察分子结构与生物过程，并早期监测疾病进展，但其临床应用依然面临诸多挑战。首要问题之一在于长波长染料的量子产率低下，这直接影响了深部组织成像的信噪比。尽管通过延长分子共轭或增强杂环末端单元可拓展染料波长，但此举往往牺牲了荧光亮度。尽管有策略如限制构象变化或引入亲水基团尝试提升亮度，但效果有限，特别是在长波长染料中，由于带隙较低，易发生能量转移，导致量子产率难以提升。封装于蛋白质疏水腔虽能改善稳定性，却牺牲了小分子染料的优势。因此，开发高效化学修饰策略以构建高量子产率的长波长染料成为亟待解决的关键问题。

此外，大斯托克斯位移染料的构建亦是当前研究的热点。斯托克斯位移对于提升荧光染料成像的信噪比至关重要，但现有策略在增加位移的同时往往牺牲了荧光亮度。我们的研究团队通过协同策略，在特定骨架的荧光团中实现了斯托克斯位移与亮度的同步提升，然而这一策略在长波染料中的应用仍具挑战。因此，探索新型方法以构建兼具长波长、高亮度与大斯托克斯位移的荧光染料成为未来研究的重要方向。

在长时间生物追踪领域，超高光稳定性的有机荧光团或成像时间延长技术同样不可或缺。尽管已有策略在一定程度上改善了荧光团的光稳定性，但成像时间的延长仍有限制。针对光漂白与三重态的关联，未来需开发更多精确调控三重态的策略，以构建超高光稳定性染料。同时，结合可逆标记技术，通过标签或蛋白质的重构，可望在活细胞中实现更长时间的示踪。此外，优化标记试剂的膜渗透性与可逆标记效率也是实现长期追踪的关键。

值得注意的是，荧光团的改性往往伴随着多种性质的相互影响，难以单一优化。因此，未来的染料设计应紧密结合应用需求，如超分辨率成像、深部组织成像、单激发多色成像、肾损伤成像及脑成像等，分别侧重于亮度、波长、斯托克斯位移、水溶性及脂溶性等特性的优化。

综上所述，本综述旨在为高性能荧光团的设计提供理论指导与启示，推动成像与传感领域探针技术的进一步发展。随着研究的深入，我们期待更多性能卓越的新型荧光团不断涌现，满足日益增长的成像需求，并在生物与生物医学研究中发挥更加重要的作用。